培养细胞的冷冻保存与复苏,细胞冻存技术

核心提示:概述
Spallanzani最早发表了冷“处理”对“细胞”生命活动影响的报道,他用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后,再将玻

核心提示:1.
细胞复苏的原则在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,

核心提示:概述细胞培养技术自1907年开创以来,历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学

概述
Spallanzani最早发表了冷“处理”对“细胞”生命活动影响的报道,他用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后,再将玻璃瓶放回室温下,发现了一个令人惊奇的现象,那些原本已经不动了的精子又“复活”了,就好象是刚从输精管排出来的一样,冷处理延长至数十分钟,情况依然如此。于是,他认为冷不能杀死精子。大约100年以后,许多早期的学者重复了低温处理对精子活动的影响,同样得出了相似的结论。到1900年前后,科学家基本上肯定了生物成分(如精子和一些生物化学物质)能够在零下温度贮存的事实。
Shettles证明人类的精子也能抵抗温度的突然变化,他将人的精液封闭在小管内,在-79℃~-196℃之间的低温条件下进行冷处理,发现有10%的精子仍然能够存活。此后,冷冻处理研究材料的范围大大拓展。
Polge
等人发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,他们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-79℃下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet与Lovelock等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman、Rey以及Smith等学者的继续和发展。1949
年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们熟悉的二甲基亚砜。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。冷冻保存与复苏原理
在低于-70℃的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。因此,采取适当的方法将生物材料降至超低温,即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时,其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存,就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件),并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存,并在适当条件下复苏。
水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。

1. 细胞复苏的原则

概述

这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降,细胞内外都结冰,产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂,则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合,从而降低冰点,减少冰晶的形成,并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质损伤,细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时,一般以很快的速度升温,1-2分钟内即恢复到常温,细胞内外不会重新形成较大的冰晶,也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间,从而无冰晶损伤和溶质损伤产生,冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
www.5524.com ,¨冷冻速率
冷冻速率是指降温的速度,直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化:当细胞被冷至-5℃时,因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点,细胞内外溶液仍未结冰;当被冷至-5~-15℃之间时,细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是,细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡,会向细胞外流动。冷冻速度不同,细胞内水分向外流动的情况也不相同:如果冷冻速度慢,细胞内水分外渗多,细胞脱水,体积缩小,细胞内溶质浓度增高,细胞内不会发生结冰;如果冷冻速度快,细胞内水分没有足够的时间外渗,结果随着温度的下降而发生细胞内结冰;如果冷冻速度非常快,则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态。Luyet证实液体的凝固可分为两种形式:一种是晶体化,溶液中的分子呈有序排列;另一种情况是非晶体即玻璃化,液体中的分子呈无序状态,保持未凝固前的状态。不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化,也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢,还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤。当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会形成较到冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏,产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。
不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.6℃~300℃/min,故对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其最适冷冻速率,以保证获得最高的冷冻存活率。
冷冻保存温度
冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止,但经过长期保存,在复苏后仍能保持正常的结构和功能。
不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果,冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发,液氮温度是目前最佳的冷冻保存温度。在-196℃/时,细胞的生命活动几乎完全停止,但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当,一般生物样品在-196℃
/下均可保存十年以上。应用-70℃/~-80℃/保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低。在冰点到-40℃
/范围内保存细胞的效果不佳。 ¨复苏速率
冷冻保护体外培养物,除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外,在复苏时也必须有最佳的复温速率,这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。
复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说,复温速度越快越好。常规的做法是,在37℃水浴中,于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢,细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生。
¨冷冻保护剂
冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲,只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中,并以最适的冷冻速率冷冻,可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说,在不加冷冻保护剂的情况下,无最适冷冻速率可言,也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中,并以0.3~600℃/min的冷冻速率降温冷冻,98%
以上的细胞会死亡;而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时,98%以上的细胞都可存活。
冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内,一般是一些小分子物质,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤,同时,细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰,在使用该类冷冻保护剂时,需要一定的时间进行预冷,让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内,在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛,但要注意的是,DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大,而在4℃
时,其毒性作用大大减弱,且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以,冻存时DMSO平衡多在4℃下进行,一般需要40~60分钟。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内,一般是些大分子物质,主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多,其中有一种可能是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合,降低溶液中自由水的含量,使冰点降低,减少冰晶的形成;同时,由于其分子量大,使溶液中电解质浓度降低,从而减轻溶质损伤。
不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂在低温下能保护细胞,但在常温下却对细胞有害,故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。冷冻保存方法
按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分,冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃~-80℃,然后直接投入液氮进行保存;或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液,按一定的降温速率从室温降至-100℃以下,再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞,直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。
¨非玻璃化冻存方法
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例,介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。主要材料
仪器设备:普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70℃~-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等;
冻存管:容量为1ml或1.5ml;
冷冻保护液:一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用,或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前,于室温下水浴溶解;
待冻存细胞:各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 澳门24小时娱乐 ,²操作过程
1.待冻存细胞悬液的制备
按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;
将细胞悬液以800~1000r/min离心5min,去上清夜;
向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×106~1×107个/ml;
按每管1~1.5ml的量分装于冻存管内,拧紧管盖;
再冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。 2.分级冷冻
先将冻存管放入普通冰箱冷藏室,约40min;
接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(-10℃~-20℃),约30~60min;
将冻存管转入低温冰箱,放置30min左右;
然后将冻存管转移到超低温冰箱(-70℃~-80℃),过夜;
最后将冻存管投入液氮保存。 3.记录
做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。
²冻存结果澳门24小时用心打造 , 如此冻存的细胞,其存活率可达90%以上。 ²讨论
在使用DMSO前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出,可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,要复苏1~2管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从-196℃的液氮中取出冻存管,立即投入37~40℃温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
¨玻璃化冻存方法 以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法(Takhashi
et al. 1986)。 ²主要材料
冷冻保护液:为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇和10%聚乙二醇而成。用2
mol/L NaOH调节pH至7.4,现配现用。
冻存管:SILASTIC玻璃小管,内径3mm,外径4.5mm; 设备:液氮储存罐;
待冻存细胞:人类外周血单核细胞。 ²冻存过程
用常规方法分离全血中单核细胞; 在冰浴中预冷冷冻保护液;
将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为:前3min以0.3ml/min速度滴加,后5min以0.6ml/min速度滴加,余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106~1.5×106个细胞/ml,边滴加边轻轻晃动离心管;
轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液;
将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液;
将冻存管两端以火焰封口;
最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为600℃/min。 ²冻存结果
如此冻存的细胞,其存活率可达90%以上。 ²讨论
玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果,不需要复杂的仪器设备,具有液氮储存设备即可使用。目前,该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用,但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。
因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高,室温下对细胞具有毒性(但在4℃时毒性大为减弱)。所以,冷冻保护液的滴加全过程必须在4℃冰浴中进行。另外,滴加速度要缓慢,如果滴加速度过快,则在细胞外产生很高的渗透压,造成细胞膜的损伤,导致细胞死亡,故要缓慢滴加,让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内,达到细胞内外的平衡。冻存细胞的复苏
¨非玻璃化冻存的复苏方法 ²主要材料 仪器设备:恒温水浴箱、高速离心机;
培养用液:完全培养液。 ² 复苏过程
调配37℃~40℃的温水,或将恒温水浴箱的温度调节至37℃~40℃;
从液氮中取出冻存管,立即投入37℃~40℃
温水中迅速晃动,直至冻存液完全溶解;
将细胞冻存悬液转移到离心管内,加入约5ml培养液,轻轻吹打混匀;
将细胞悬液经800~1000r/min离心5min,弃上清夜;
向细胞沉淀内加入完全培养液,轻轻吹打混匀,将细胞悬液转移到培养瓶内,补足培养液进行培养。
² 结果 复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力,活细胞数达90%以上。 ² 讨论
细胞冻存悬液一旦融解后,要尽快离心除去冷冻保护液,防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中,同样应具有自我保护意识,避免被液氮冻伤。
n 玻璃化冻存的复苏方法 以下以人的单核细胞为例说明其过程(Takhashi et al.
1986)。 ² 主要材料 设备:高速离心机;
培养用液:添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。 ² 操作过程
将冻存管从液氮中取出,立即投入冰浴中5min。复温速率约560℃/min。一次可以进行多个冻存管的复苏;
将冻存管两端剪断,可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中;
沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入,后10min以0.5ml
/min的速度加入,接着的15min以0.75ml/min的速度加入,最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min,都在冰浴中进行;
将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min,去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞,用于培养。
² 结果 复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力,活细胞数达90%以上。 ² 讨论
复苏时,冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样,不能在室温下而必须在4℃冰浴中进行,避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行,保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出,以达到细胞内外的平衡,避免高渗透压的损伤。

在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。

细胞培养技术自1907年开创以来,历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天,细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。

2. 细胞复苏的主要操作步骤

低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0~196℃进行保存,就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度,并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20~40℃
冰箱保存、-60~80℃深低温冰箱和液氮超低温保存等。

佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

应用方向

迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌下取出细胞。

  1. 医学方面

在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。

近年来干细胞的研究越来越被人们关注,由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,可分化为多种功能细胞。

3. 注意事项

根据发育阶段和取材来源,干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。

在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。

骨髓干细胞在骨髓中含量极少,约占骨髓有核细胞的十万分之一,所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。

技术总结要点

  1. 生物学方面

1. 冷冻速度

细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天,更是尤为关键,虽然不是治本的方法,但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。

冷冻速度也就是降温的速度,它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同,细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢,细胞内水分外渗多,细胞脱水,体积缩小,同时细胞内溶质浓度增高,细胞内不发生结冰;冷冻速度过快,细胞内水分没有足够时间外渗,随着温度的下降,细胞内会发生结冰;如果冷冻速度非常快,细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固。

发展历史

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化,同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢,细胞严重脱水,体积急剧收缩.超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶液损伤。冷冻速度过快,细胞内水分来不及外渗,会在胞内形成较大冰晶,造成细胞膜和细胞器的损伤,产生细胞内冰晶损伤。1937年,Luyet实液体的凝固可分为两种形式:一种是晶体化,液体中的分子呈有序的排列;另一种为非晶体化即玻璃化,液体中的分子呈无序排列,保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不造成破坏;细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

  1. 1776年,Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。

  2. 十九世纪中后叶,许多早期的工作者(Prevost,1840;de
    Quatrefages,1853;Mantegazza,1866;Scheuk,1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响,得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。

  3. 1900年前后,科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。

不同细胞的最适冷冻速度不同,主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配;同时还取决于细胞的表面积与体积之比,以及细胞膜的渗透率。一般来说,小细胞对水通透性强,适用于快冻,最佳冷冻速率较高,可达103℃/min或更高;相反大的细胞或组织,如直径100nm以上的胚胎,对水的通透性弱,则适于慢冻。此外,最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温,一般认为降温速率以1~5
℃/min为最佳。

4.
二十世纪50年代,Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用,他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。

2. 冷冻保存温度

5.
1972年,Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析,提出关于冷冻损伤的两因素假说目,即冰晶损伤和溶液损伤假说。

冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。

这个假说认为随着温度的下降,细胞内外的水分结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular
ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成,冷却速度越快,冰晶损伤越大。

冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度是目前最佳冷冻保存温度。在-196
℃时,细胞生命活动几乎停止,但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70~-80
℃条件冷冻保存细胞,短期内对细胞活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低。在0~40℃范围内保存细胞效果不佳。

同时随着温度的下降,细胞外部的水分会先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高,细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏,细胞发生渗漏,导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution
damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢,使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成,冷却速度越慢,此损伤越严重。

3. 复苏

主要技术

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物,除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外,在复苏时也需要有最佳的复温速度,这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比,复温过程的研究显得薄弱得多。

冻存技术

复温速度不当同样会造成细胞损伤,降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快,持续时间也很短,原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现,冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤,反而是在复温过程中,复温到-40℃或者更高的温度时,细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是,在37℃水浴中,于1~2min内完成复温,也就是通常采用的快速复苏。因此,最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。

1. 液氮法

4. 冻存保护剂

目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

冻存保护剂(Cryoprotectant)是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合,发生水合作用,弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成.同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质,可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜(Dimethyl
Sulfoxide,DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时,需要一定时间进行预冷,在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有35L3和50L3两种。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质,不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多,其中一种可能是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合,降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成;同时,由于其分子量大,使溶液中电解质浓度降低,从而减轻溶质损伤。

细胞冻存时常备的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%~20%的血清培养液,DMSO或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒),2ml安瓿、吸管、离心管、喷灯、纱布袋等。

不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞,在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。

主要操作步骤为:

选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25%
胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。

去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/ml之间。

将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中,安瓿装1~1.5ml在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时,再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,最后沉入液氮中。

2. 分布降温法

细胞系冻存程序:

1)
单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液,加适量ATV,1~2分钟后倒弃ATV,再加入少量ATV液,经0.5~1分钟倒去ATV,室温或37oC温箱作用2~3分钟,视细胞解离情况,拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞,待生长好后用吸管吹打,再经1000转/分离心l0分钟。

2)
离心洗涤:向培养瓶内加5~10m1预冷的MEM使细胞悬浮,再将其吸出置灭菌离心管中,以1000rpm
离心8~10分钟后弃去上清液。

3)
细胞悬液的制备:向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液,使细胞浓度为150~400万/ml,然后迅速分装于安瓿瓶中,每瓶加量为lml。

4)
致冷冻结:将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内,直立置不同条件下致冷冻结果保存:

a.
4℃两小时后移至-20℃作用2小时,再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。

b. -20℃4小时后移至-40℃,经4小时移人-70℃冰箱24小时,投入液氮。

c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。

d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。

e. -70℃24小时后投入液氮中。

5)
液氮中保存:将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中,投入液氮。为防止安瓿漂浮,可预先在小布袋中加入几块小卵石。

3. 玻璃化法

玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞,使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质,而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高,又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤,可获得较高存活率。

玻璃化首先由Luyet在1937年提出,他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列.并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡,而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列,这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小,因而是一种较理想的低温保存途径。

1981年,Fahy首先明确提出,用高浓度的低温保护剂溶液,可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化,以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”,使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。

1985年,Rail和Fahy用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功,是这种技术走向实用化的首次突破。

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